qpcr實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

    在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，qPCR儀通常被用于基因表達(dá)分析、病毒載量檢測(cè)等需要精確定量的實(shí)驗(yàn)。但很多實(shí)驗(yàn)人員可能遇到過(guò)這樣的情況：實(shí)驗(yàn)室里只有一臺(tái)qPCR儀，而手頭的實(shí)驗(yàn)只需要做一個(gè)普通的PCR擴(kuò)增——比如菌落PCR鑒定、基因型分析或者目的片段克隆。這時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)疑問(wèn)：qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR？它能不能替代普通PCR儀完成這些定性擴(kuò)增任務(wù)？

    答案很明確：qPCR儀器可以用來(lái)做普通PCR，只需在設(shè)置程序時(shí)不選擇熒光采集，反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物取出進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)即可。qPCR儀本質(zhì)上是一臺(tái)集成了光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的高性能PCR儀，其熱循環(huán)模塊與普通PCR儀并無(wú)本質(zhì)區(qū)別——兩者都是通過(guò)精確控溫驅(qū)動(dòng)DNA變性和擴(kuò)增。因此，qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR，核心在于“關(guān)閉定量功能，保留擴(kuò)增功能"，用它的熱循環(huán)模塊完成擴(kuò)增，再像普通PCR一樣跑膠看條帶。

一、qPCR儀與普通PCR儀的異同

    在深入操作步驟之前，有必要先理解qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR的硬件基礎(chǔ)。

    qPCR儀和普通PCR儀的核心熱循環(huán)模塊是相同的——兩者都采用半導(dǎo)體帕爾貼技術(shù)進(jìn)行升降溫控制，都配備熱蓋防止反應(yīng)液蒸發(fā)，溫度精度和均一性也處于同一水平。qPCR儀與普通PCR儀的區(qū)別在于，qPCR儀在熱循環(huán)模塊的基礎(chǔ)上集成了激發(fā)光源、熒光檢測(cè)器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。這套光學(xué)系統(tǒng)正是qPCR實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量的關(guān)鍵，也是它與普通PCR儀在功能上的分水嶺。

    因此，qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR的邏輯就很清晰了：如果我們?cè)谠O(shè)置程序時(shí)不啟動(dòng)熒光采集，那么qPCR儀就等同于一臺(tái)普通PCR儀——它只會(huì)執(zhí)行溫度循環(huán)程序，不會(huì)記錄任何熒光信號(hào)。擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物取出進(jìn)行凝膠電泳，就能像普通PCR一樣通過(guò)條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。

二、操作步驟：從創(chuàng)建程序到產(chǎn)物檢測(cè)

    在了解了qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR的基本邏輯之后，以下是具體的操作步驟。以賽默飛QuantStudio系列為例，其他品牌qPCR儀的操作邏輯類(lèi)似。

    第一步：創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)，選擇“普通PCR"模式或不選擇熒光通道

    打開(kāi)qPCR儀配套軟件，在新建實(shí)驗(yàn)界面中，部分儀器會(huì)直接提供“常規(guī)PCR"或“僅擴(kuò)增"模式選項(xiàng)，選擇該模式即可。如果儀器沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的普通PCR模式，可以在熒光通道設(shè)置中不勾選任何熒光通道，或者將熒光采集步驟關(guān)閉。這樣設(shè)置后，儀器在運(yùn)行過(guò)程中不會(huì)激發(fā)光源，也不會(huì)記錄熒光數(shù)據(jù)，等同于一臺(tái)普通PCR儀。

    這一步是qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR的關(guān)鍵操作——告訴儀器“不需要定量，只需要擴(kuò)增"。

    第二步：設(shè)置熱循環(huán)程序

    按照普通PCR的標(biāo)準(zhǔn)程序設(shè)置溫度循環(huán)。典型的PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C、2-5分鐘；循環(huán)步驟95°C、15-30秒→55-65°C、15-30秒退火→72°C、30-60秒延伸，循環(huán)數(shù)30-35次；終延伸72°C、5-10分鐘；4°C保持。

    第三步：準(zhǔn)備反應(yīng)體系

    qPCR儀器用來(lái)做普通PCR時(shí)，反應(yīng)體系的配制與普通PCR一致——使用普通的TaqDNA聚合酶和dNTPs即可，不需要使用昂貴的qPCR預(yù)混液（含熒光染料或探針）。這樣可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

    使用與qPCR儀兼容的PCR管、8聯(lián)管或96孔板。需要注意的是，如果使用96孔板，封板膜可以使用普通封板膜，無(wú)需使用光學(xué)封板膜——因?yàn)闆](méi)有熒光采集需求，對(duì)透光性沒(méi)有特殊要求。這也是qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR在耗材選擇上與qPCR的一個(gè)區(qū)別。

    第四步：放入儀器，啟動(dòng)運(yùn)行

    將裝有反應(yīng)體系的PCR管或板放入qPCR儀的模塊中，關(guān)閉熱蓋，確認(rèn)鎖扣到位。檢查程序設(shè)置無(wú)誤后，點(diǎn)擊啟動(dòng)按鈕。儀器開(kāi)始執(zhí)行溫度循環(huán)程序。運(yùn)行過(guò)程中可以實(shí)時(shí)查看當(dāng)前溫度和剩余時(shí)間，但沒(méi)有擴(kuò)增曲線顯示——因?yàn)闆](méi)有開(kāi)啟熒光采集。

    第五步：取出產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)

    程序運(yùn)行結(jié)束后，打開(kāi)熱蓋，取出PCR產(chǎn)物。將產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠上樣孔中，同時(shí)加入合適的DNA分子量Marker作為參照。在適當(dāng)電壓下電泳，待指示染料遷移到凝膠三分之二處時(shí)停止電泳。將凝膠放入核酸染料溶液中染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期一致，條帶是否清晰單一。

    至此，qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR的完整流程就完成了——從程序設(shè)置、反應(yīng)體系配制、上機(jī)運(yùn)行到產(chǎn)物檢測(cè)，與普通PCR的操作流程一致。

三、操作中的注意事項(xiàng)

    耗材兼容性：qPCR儀對(duì)PCR管和板的規(guī)格有特定要求，使用前需確認(rèn)耗材與儀器兼容。如果使用96孔板，可以使用普通封板膜，無(wú)需光學(xué)膜。程序設(shè)置：務(wù)必關(guān)閉熒光采集，否則儀器會(huì)在運(yùn)行過(guò)程中反復(fù)激發(fā)光源，既無(wú)必要又可能縮短光源壽命。反應(yīng)體積：qPCR儀通常支持10-100μL的反應(yīng)體積，普通PCR常用20-50μL，在儀器兼容范圍內(nèi)即可。

    qPCR儀器用來(lái)做普通PCR的優(yōu)缺點(diǎn)

    優(yōu)點(diǎn)方面，qPCR儀的溫度控制精度通常較高，能夠提供更穩(wěn)定的擴(kuò)增效果；升降溫速率也更快，有些機(jī)型支持快速模式，可在較短時(shí)間內(nèi)完成PCR。此外，一機(jī)多用減少了實(shí)驗(yàn)室對(duì)多臺(tái)設(shè)備的依賴(lài)，節(jié)省空間和預(yù)算。缺點(diǎn)方面，qPCR儀通常價(jià)格較高，僅用于普通PCR有些大材小用；試劑成本方面，如果誤用了qPCR專(zhuān)用預(yù)混液，成本會(huì)顯著高于普通PCR。此外，qPCR儀的通量相對(duì)固定，不如專(zhuān)門(mén)的普通PCR儀靈活。

總結(jié)

    qPCR儀器怎么用來(lái)做普通PCR？答案很明確：設(shè)置程序時(shí)關(guān)閉熒光采集，使用普通PCR試劑配制反應(yīng)體系，放入儀器啟動(dòng)運(yùn)行，擴(kuò)增結(jié)束后取出產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。qPCR儀本質(zhì)上是一臺(tái)帶有光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的高性能PCR儀，去掉光學(xué)檢測(cè)這一步，它就是一臺(tái)高質(zhì)量的普通PCR儀。在日常實(shí)驗(yàn)中，如果實(shí)驗(yàn)室只有qPCR儀而需要做普通PCR擴(kuò)增，可以按上述步驟操作，無(wú)需額外購(gòu)置普通PCR儀。

如果您有采購(gòu)qPCR儀的需求，點(diǎn)擊跳轉(zhuǎn)商品頁(yè)并聯(lián)系我們。