如何傳代貼壁細胞？

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細胞成單個細胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價離子的螯合劑，能抑制細胞膜上的Ca²⁺和Mg²⁺。常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca²⁺和Mg²⁺的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ，觀察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要5-15分鐘，為了避免細胞成團，消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化，細胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的*培養(yǎng)基中止消化，血清中某些蛋白質能夠抑制胰酶的活性。一般情況下，離心并不需要。如果細胞需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基，可以以125000g 轉速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養(yǎng)基，加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細胞，移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產生損傷，對于這種類型的細胞，可用細胞刮輕輕刮下細胞，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細胞，然后進行傳代培養(yǎng)。

傳代細胞的頻率多久較合適？

 傳代是指把細胞從一個培養(yǎng)瓶移到另一個培養(yǎng)瓶，傳代的間隔是指兩次傳代之間的時間。貼壁型的細胞的匯合度達到或者接近100%的時候，需進行傳代操作，但是，有些細胞以克隆的形式生長，匯合度永遠達不到100%，對于這種類型的細胞，細胞達到或者接近大密度的時候，就需傳代。接觸抑制型細胞（比如3T3）需要在細胞長滿之前傳代以避免產生細胞長滿后接觸抑制后產生性狀的改變。懸浮型的細胞必須在細胞達到大飽和密度之前傳代，懸浮細胞傳代時只需稀釋至合適的密度，讓細胞有充足的營養(yǎng)恢復到對數(shù)生長期。如果僅僅是簡單的換液，而且細胞數(shù)量不減少，細胞將會快速耗盡營養(yǎng)而死亡；如果細胞稀釋到低密度之下，細胞將會進入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細胞的大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的，所以，培養(yǎng)懸浮細胞要每日觀察。

胰酶消化傳代的濃度是多少？是否含EDTA？濃度？

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%，部分細胞由于貼壁較緊，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培養(yǎng)，胰酶的濃度需要做適當?shù)奶岣摺?/span>

細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？

不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca²⁺, Mg²⁺和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 ℃ 其作用能力優(yōu)勢。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
（2）0.25％胰蛋白酶＋0.03％EDTA。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液pH8.0~9.0；使用D-Hank液配制。 
多數(shù)細胞傳代消化可使用0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。  

能否使用細胞說明書上不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞？

產品目錄或者細胞說明書上的推薦的培養(yǎng)基一般是細胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經經過驗證的對該細胞株合適的培養(yǎng)基，細胞對未推薦的培養(yǎng)基也許會適應，也有可能不適應。對于更換培養(yǎng)基，應謹慎對待，更換培養(yǎng)基時，應留一瓶細胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，留作種子。更換培養(yǎng)基有兩種方法，簡單的方法是直接更換培養(yǎng)基，強制使細胞適應新的培養(yǎng)基；還有一種更溫和的方法：傳代細胞的時候分成細胞兩瓶，一瓶使用原來推薦的培養(yǎng)基，第二瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，之后仔細觀察細胞的生長狀態(tài)，如果第二瓶細胞生長狀態(tài)不好，應立即停止更換培養(yǎng)基，如果第二瓶生長狀態(tài)好，可以繼續(xù)傳代分瓶，一瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，另一瓶使用25%原來推薦的培養(yǎng)基，75%新的培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察，如果細胞狀態(tài)好，可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。
 
PS:
培養(yǎng)懸浮細胞，如何更換培養(yǎng)基？
如果空間足夠，只需添加適量的新鮮培養(yǎng)基，這是培養(yǎng)懸浮細胞時更換培養(yǎng)基的方法（少數(shù)細胞除外）；也可以通過離心（1000g / 5min）去除舊的培養(yǎng)基后，用新鮮的培養(yǎng)基輕輕地重懸細胞，移入培養(yǎng)瓶。